近年来，随着社会对环保和食品安全要求的日益提高，研究者们提出利用可生物降解和环境友好的材料开发食品活性包装，在保证食品质量安全的情况下，提高食品的货架期。各种天然生物聚合物，如蛋白(明胶、大豆分离蛋白等)、多糖(淀粉、魔芋葡甘聚糖、壳聚糖、纤维素等)因其优越的成膜性及可再生性被应用于食品包装膜的开发。其中，明胶(Gelatin，Gel)是一种水溶性蛋白，成膜性好、透明度高，具有无毒、可降解和生物相容性等优点[1]；但纯明胶膜由于亲水性强、阻隔性能差，缺乏抑菌和抗氧化活性，阻碍了其在食品包装上的应用。山苍子油(Litsea cubeba oil，LCO)主要从山苍子鲜果中提取，具有较强的抑菌和抗氧化活性[2]。玉米醇溶蛋白(Zein)存在于玉米胚乳中，具有安全无毒、生物相容性等优点，其氨基酸基团引起的疏水性使其在极性溶剂下能自组装形成纳米粒子[3]。前期工作已利用反溶剂沉淀法制备包载山苍子油的醇溶蛋白纳米粒子，具有较强的抑菌和抗氧化性能。

生物聚合物薄膜是添加剂的优良载体，将功能性纳米粒子添加到生物聚合物基质可以改善薄膜的性能[4,5]。如Sooch等[6]向明胶中添加氧化铜纳米粒子，制备的食品包装膜具有较好的抑菌活性，提高了番茄的货架期。Maroufi等[7]将含有百里香酚的玉米醇溶蛋白纳米粒子与明胶共混，制得具有良好抗氧化和抑菌活性的薄膜。因此，本文将以明胶、玉米醇溶蛋白和山苍子油为基材，制备包载山苍子油的醇溶蛋白纳米粒子/明胶复合膜。研究成膜组分间的相互作用，以及不同纳米粒子添加量对复合膜的微观结构、热性能、机械性能、疏水性能、抑菌和抗氧化性能的影响，以期为食品活性包装的开发提供一定参考依据。

明胶(Mw=1.368×105 Da)　　国药集团化学试剂有限公司；玉米醇溶蛋白(Mw=2.5~4.5×104 Da)　　百灵威试剂有限公司；山苍子油　　江西亿森源植物香料有限公司；Span 80(脱水山梨糖醇单油酸酯)、甘油　　国药集团化学试剂有限公司。

DNG-9031A烘箱　　中国上海精宏有限公司；DSA25接触角测量仪　　德国克鲁斯公司；DSC-Q10差示扫描量热仪　　美国梅特勒公司；TA. XT. Plus质构仪　　英国SMS公司；SC 502扫描电子显微镜　　日本东京日立公司；W3/031水蒸气透过率仪　　济南兰光有限公司。

通过反溶剂沉淀法制备NL分散液[8]。将0.2 g zein溶解在10 mL乙醇/水(85:15，v/v)中，在25 ℃下搅拌30 min得到zein溶液。将0.1 g LCO添加到zein溶液中，以600 r/min搅拌1 h。将混合溶液滴加到吐温80/水溶液(0.5:100，w/v)中，用均质机以13000 r/min的速度剪切2 min，形成包载山苍子油的醇溶蛋白纳米粒子分散液。通过纳米粒度仪测得纳米粒子粒径为(128.3±1.1) nm。

膜的原料配比见表1，制备流程如图1所示。将甘油和明胶溶解在蒸馏水中，在60 ℃以200 r/min搅拌0.5 h得到明胶溶液。将Span 80溶解于制备好的NL分散液中，在25 ℃以200 r/min磁力搅拌10 min。将分散液加入到明胶溶液中制备成膜液，搅拌0.5 h，搅拌速度600 r/min。然后将成膜液倒入圆形平皿(14 cm×14 cm×15 cm)，于30 ℃烘箱中干燥10 h得到膜样品。纯明胶膜和复合膜分别记为Gel、Gel-NL20、Gel-NL30、Gel-NL40、Gel-NL50。膜样品测试前在25 ℃±1 ℃、相对湿度50%±2%的条件下平衡48 h。

膜的颜色测定采用色度计，以白色标准色板(L=89.74，a=0.04，b=1.64)作为背景进行测量。ΔL、Δa和Δb是标准色板与膜样品之间的颜色差异。总色差(ΔE)计算如下[9]：

ΔE=(ΔL)2+(Δa)2+(Δb)2−−−−−−−−−−−−−−−−−−−√ΔE=ΔL2+Δa2+Δb2

膜的不透明度计算如下[10]：

不透明度=Abs600x不透明度=Abs600x；式中: Abs600为600 nm处的吸光度值，x为膜的厚度(mm)。

采用紫外可见分光光度计在240–500 nm的波长范围内扫描膜的紫外吸收光谱。

将膜样品(3 mm×3 mm)在×1000倍下利用扫描电子显微镜观察横截面。样品在7.5 Pa真空度下喷金，喷金厚度为20 nm，时间为90 s，加速电压为30 kV。

采用衰减全反射傅里叶变换红外光谱仪对样品进行扫描分析。扫描波长为4000–400 cm–1，共有32次完整扫描，分辨率为4 cm–1。

利用差示扫描量热仪对样品进行热性能分析。在干燥N2的条件下，将膜样品(约3 mg)置于梅特勒皿中。检测温度为30–120 ℃，升温速率为10 ℃/min。用10.00版STARe(Mettler Toledo, Zurich, Switzerland)进行数据分析。

将膜裁成5 mm×50 mm的长条。根据ASTM D882-09的方法[11]，膜的拉伸强度(TS)和断裂伸长率(EAB)通过质构仪进行测试。测试条件：初始握柄分离30 mm，十字头移动速率为0.5 mm/s。TS和EAB根据以下公式计算:

TS(MPa)=FmaxSTSMPa=FmaxS

EAB(%)=(L−L0)L0×100EAB%=L-L0L0×100

式中：Fmax为膜断裂时的力( N); S为膜的截面面积(mm2); L为膜断裂时的最终长度(mm); L0为膜样品的初始长度(mm)。

采用接触角测量仪测定膜的水接触角。膜样品(3 cm×3 cm)固定于载玻片上，置于水平移动平台，将3 μL蒸馏水滴在膜上，测量第30 s的水接触角[12]。

采用水蒸气透过率仪测定膜的水蒸气透过率。根据GB/T 1037-1988的方法[13]测试，将膜样品裁成适合的尺寸，组装透湿杯(装有25 mL蒸馏水)并放入测试室。在连续模式下设置温度为25 ℃，相对湿度为75%。

将200 mg膜样品浸泡在10 mL乙醇/水(85:15，v/v)中，得到20 mg/mL膜样品溶液。

取200 μL膜样品溶液加入到100 μL的0.1 mmol/L DPPH(2,2-二苯基-1-苦基肼基)乙醇溶液中。在25 ℃条件下避光混合30 min，在517 nm处测定吸光值。

DPPH清除率(%)=ADPPH−AfilmADPPH×100DPPH清除率%=ADPPH-AfilmADPPH×100

式中：ADPPH和Afilm分别为DPPH乙醇溶液和膜样品在517 nm处的吸光值。

取4 mL 7 mmol/L ABTS[2,2'-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)]溶液加入88 μL过硫酸钾溶液 (140 mmol/L), 混合均匀，在25 ℃下避光静置16 h，作为储备液。用乙醇/水(95:5，v/v)稀释储备液作为工作液。取100 μL膜样品溶液加入到100 μL的ABTS工作液中，在25 ℃条件下避光混合30 min，在734 nm处测定吸光值。

ABTS清除率(%)=AABTS−AfilmAABTS×100ABTS清除率(%)=AABTS-AfilmAABTS×100

式中：AABTS和Afilm分别为ABTS乙醇溶液和膜样品在734 nm处的吸光值。

将LB固体培养基(15 mL)加入培养皿中，待完全固化后，加入100 μL菌悬液(约106 CFU/mL)均匀涂布于表面；然后将膜样品(直径10 mm)放置在培养基表面，在37 ℃培养24 h。阴性对照为明胶膜，抑菌活性通过抑制圈表示。

每个实验至少重复测定三次，结果用平均值±SD(标准差)表示。采用Origin软件绘图；SPSS软件进行单因素方差分析，Tukey法进行显著性检验，不同字母表示具有显著性差异(P<0.05)。

纯明胶膜和复合膜的颜色如表2所示。随着NL添加量的增大，复合膜的明度(L*)和红度(a*)降低，黄度(b*)增加，表明复合膜颜色逐渐变黄；ΔE增加，表明复合膜颜色变化增大，这与NL的颜色有关。随着NL添加量的增大，膜的不透明度从0.37显著增加到5.61(P<0.05)，这是由于纳米粒子和LCO对光的散射或透过产生了干扰[14]。复合膜的透明度低，作为包装材料能有效防止食品的光氧化和变色。由图2可知，纯明胶膜的紫外阻隔性能最弱；随着NL添加量的增大，复合膜的吸光度增大，紫外光透过率降低，意味着复合膜在250–280 nm具有良好的紫外阻隔性能。这可能是由于LCO含有多酚类物质，其芳香族基团对紫外吸收性能较强[15]。

膜的截面微观形态如图3所示。纯明胶膜截面结构紧凑，NL的添加破坏了明胶基质的原生结构。在复合膜中，Gel-NL30截面相对致密，可能是NL和明胶之间发生了较强的相互作用；Gel-NL20和Gel-NL40的截面出现大小不同的微孔洞，粗糙度增加，可能是由于较小的油滴聚集所致[16]。Gel-NL50的截面最粗糙，存在不连续且部分断裂的结构，可能是纳米粒子发生了聚集。膜在干燥过程中，由于乙醇溶剂的挥发比水分子快，NL因疏水相互作用或热诱导交联发生聚集，形成较大的颗粒，导致膜的截面有凸起、不致密[17]。

膜的红外光谱如图4所示。对于纯明胶膜，波数3298 cm–1处的峰是-OH基团对应的氢键特征峰[18]；波数2935 cm–1对应于C-H基团的拉伸振动；1631 cm-1和1541 cm-1处的峰是C=O和N-H基团的拉伸振动；1450到1236 cm-1之间的峰对应C-N和N-H的拉伸振动；1034 cm-1处的峰对应于甘油中O-H拉伸振动[19]。与纯明胶膜相比，复合膜光谱吸收峰从3298 cm-1移动到3285 cm-1，是由于明胶中的氢键和O-H拉伸，意味着氢键交联的增强[20]，明胶与NL之间发生了氢键相互作用。复合膜中没有发现新峰，说明明胶与NL之间没有形成化学键。此结果与Shen等[21]向普鲁兰-明胶溶液中添加丁香精油纳米乳液的研究结果类似。

差示扫描量热曲线分析反映膜材料的热稳定性及膜组分间的相容性。如图5所示，纯明胶膜在87.22 ℃出现一个吸收峰，在此温度下，明胶膜由玻璃态向高弹态转变，对应的温度为玻璃化转变温度(Tg)[22]，与Chen等[23]研究结果一致。NL、Gel-NL20、Gel-NL30、Gel-NL40和Gel-NL50的Tg分别为68.07、84.42、90.04、80.40和80.41 ℃。Gel-NL30复合膜的Tg最高，可能是膜中明胶和NL之间的氢键相互作用最强，使得有更大的空间位阻，限制了生物聚合物的运动[19]。复合膜均表现出单一的Tg，表明聚合物各组分相容性良好。此现象与含有玉米醇溶蛋白/百里酚纳米粒子的明胶膜的热稳定性类似[23]。

拉伸强度和断裂伸长率用于表征膜的机械性能，拉伸强度越大，表明膜的外力承受性越强；断裂伸长率越大，表明膜的延展性越好。如图6所示，纯明胶膜的拉伸强度为(6.54±0.14) MPa，断裂伸长率为5.13%±0.52%。当添加NL时，复合膜的拉伸强度降低，可能与不同NL含量下膜的微观结构有关。断裂伸长率在Gel-NL30中最大(15.61%±0.96%)，之后随着NL添加量的增加而下降。由于复合膜的机械性能与纳米粒子的形态和聚合物的性质有关，可能是NL在明胶基质中起到“增塑”的作用，与初始聚合物链相比，增加了聚合物链的迁移率，从而增加断裂伸长率[24]；而继续增加NL的添加量，膜中NL聚集成大颗粒，可能对膜中分子滑移有一定的抑制作用，复合膜的延展性降低，从而降低其断裂伸长率。

水接触角与WVP值用来评估膜材料的疏水性能。水接触角越大，WVP值越小，表明材料的疏水性能越好。如图7(A)所示，纯明胶膜的水接触角为39.01°，意味着其表面亲水性较好。复合膜的水接触角明显大于纯明胶膜的水接触角(P<0.05)，表明NL的添加提高了复合膜的表面疏水性。随着NL添加量的增大，复合膜的水接触角显著增大(P<0.05)，疏水性增强，可能是由于明胶与NL之间的氢键相互作用降低了明胶在膜表面可用的亲水基团。如图7(B)所示，纯明胶膜的WVP值为(16.29±0.29)×10–11 g·cm/ (cm2·s·Pa)，与Ali等[16]研究结果相似。随着NL添加量的增大，复合膜的WVP值呈下降趋势，对水蒸气的阻隔性能增强。这是由于膜中存在纳米粒子，使水分子扩散通道变得曲折狭窄，传质效率降低[25]。研究报道，与纳米粒子共混后，可以通过增加生物聚合物的结晶度或减少明胶基质中的自由亲水基团来降低水蒸气的渗透性[26]。此外，醇溶蛋白和LCO的疏水性增加了亲水分子的传质阻力。

本实验采用DPPH和ABTS自由基清除法来评价膜的抗氧化性能。由图8可知，纯明胶膜对DPPH和ABTS自由基的清除率分别为10.07%±2.13%和27.23%±1.62%，抗氧化活性较差，可能归因于明胶肽的抗氧化特性[27]。随着NL添加量的增大，复合膜对两种自由基的清除率显著增大(P<0.05)，抗氧化活性增强，主要是由于NL中的LCO含有柠檬醛、萜类等多种生物活性化合物，协同作用后具有较高的抗氧化活性[28]。Gel-NL50复合膜对DPPH和ABTS的清除率最大，分别为44.53%±3.05%和78.30%±1.47%。类似的Roy等[29]发现明胶/琼脂基复合膜的抗氧化活性随着丁香精油含量的增加而增强。

食源性致病菌是影响食品质量和安全的重要因素，因此复合膜的抑菌性能很重要。纯明胶膜对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均无抑菌活性，复合膜对两种菌表现出抑菌活性(图9)。Wang和Liu[30]利用气相色谱-质谱技术对LCO分析，发现柠檬醛(63.75%)和柠檬烯(7.38%)是LCO的主要成分。柠檬醛具有很强的抑菌活性，由于其具有亲脂性，能穿透并破坏细菌的内膜和外膜[2]。Gel-NL20、Gel-NL30和Gel-NL40对大肠杆菌的抑菌效果无显著差异(抑菌圈直径9.17–9.45 mm)，对金黄色葡萄球菌的抑菌效果也无显著差异(抑菌圈直径10.02–10.35 mm)。Gel-NL50对两种菌的抑菌效果显著高于其它膜，其对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径分别为(10.00±0.20) mm和(11.10±0.12) mm。复合膜的抑菌活性不仅与NL的浓度有关，还取决于菌种的类型。与大肠杆菌相比，复合膜对金黄色葡萄球菌的抑制作用较强，可能是革兰氏阳性菌细胞膜中的脂磷壁酸有助于LCO的渗透，而革兰氏阴性菌固有的外源性膜限制了LCO通过脂多糖层的扩散[31]。

本文研究了不同NL添加量对明胶基复合膜结构与性能的影响。结果表明，明胶中添加NL后，仍具有较好的成膜性；随着NL添加量的增大，复合膜的紫外阻隔性能和抗氧化性能增强，水接触角增大，水蒸气透过率降低；复合膜对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均有明显的抑制作用；其中Gel-NL30复合膜的截面最致密，断裂伸长率最大(15.61%±0.96%)，玻璃化转变温度(Tg)最高(90.04 ℃)，这可能与NL和明胶之间相容性良好以及在成膜过程中形成氢键有关。综上，Gel-NL30的理化性能最佳，可作为一种食品活性包装材料。后续关于复合膜的成膜机理、活性成分缓释以及在食品保鲜中的应用效果评价还需要进一步的研究。