TRAAK离子通道第4次跨膜结构对其机械敏感性的作用
发布时间:2020年7月8日 点击数:2956
钾离子通道对于人体的神经元放电、心脏跳动以及胰岛素分泌等生理功能具有非常重要的意义
最近的研究发现，大多数双孔钾通道具有电压依赖性
最近的研究已经将人的TRAAK通道（KCNK4）的4种晶体结构解析出来，PDB ID分别为4I9W、3UM7、4RUF、4RUE
1 材料与方法
1.1 材料
大肠杆菌E.coli DH5α感受态细胞购自近岸蛋白科技有限公司；LB肉汤培养基和抗生素购自生工生物工程（上海）股份有限公司；2 000bp DNA Marker和Gelstain等化学试剂购自北京全式金生物技术有限公司；氯化钠，氯化钾，HEPES,EGTA等化学试剂购自Sigma公司；胎牛血清购自Vian Saga公司；HEK293T细胞为本实验室保存的细胞系；pIRES-TRAAK-EGFP和pIRES-TWIK-1-EGFP为本实验室保存质粒；引物合成和DNA测序由上海睿迪生物科技有限公司完成；PrimeSTAR MAX DNA Polymerase购自TaKaRa公司；DNA凝胶回收试剂盒和质粒抽提试剂盒以及同源重组酶CloneExpressⅡOne Step Cloning Kit等化学试剂购自南京诺唯赞生物科技有限公司；转染试剂Lipofectamine 3000和P3000购自上海翊圣生物科技有限公司；哺乳动物细胞DMEM培养基购自Sigma公司；高速冷冻离心机购自Eppendorf公司，核酸电泳仪和PCR扩增仪为Bio-Rad公司产品；凝胶成像仪为Clinx公司产品；数模转换器、放大器和显微操作器为AXON公司产品；程控微电极拉制仪为SUTTER公司产品；抛光仪为NARISHIGE公司产品；负压仪器Suction Control Pro unit为Nanion公司产品．
1.2 克隆构建
嵌合突变体M4-chimera的构建：分别以质粒pIRES-TWIK-1-EGFP和pIRES-TRAAK-EGFP为模板，表1中的M4-chimera-F1/R1和M4-chimera-F2/R2为引物进行PCR扩增得到两个目的片段，将目的片段进行凝胶回收，使用同源重组酶进行连接，转化然后挑菌、摇床培养，通过测序和序列比对得到新构建的质粒；分别以新构建的质粒和pIRES-TRAAK-EGFP为模板，表1中的M4-chimera-F3/R3和M4-chimera-F4/R4为引物扩增得到两个目的片段，然后通过凝胶回收、连接和转化等过程得到嵌合突变体M4-chimera.
嵌合突变体M4-upper-chimera和M4-lower-chimera的构建：分别以表1中的M4-upper-chimera-F/R和M4-lower-chimera-F/R为引物，以pIRES-TRAAK-EGFP为模板进行PCR扩增得到目的基因片段，然后通过凝胶回收、连接和转化等过程得到嵌合突变体M4-upper-chimera和M4-lower-chimera.
1.3 HEK293T细胞培养及转染
HEK293T细胞培养：在显微镜下观察细胞，细胞生长状态良好（细胞密度均匀，并且细胞没有大量聚集在一起）；弃掉培养皿中的培养基，用PBS清洗两次，去除细胞表面杂质；加入1mL浓度为0.25%的胰蛋白酶消化细胞，当细胞开始从培养皿的底部脱落时，吹打细胞，将细胞轻轻悬浮起来；转移细胞至15mL离心管中，加入1mL细胞培养基（DMEM培养基加入10%的澳洲胎牛血清和100×的青霉素-链霉素），1 000r/min离心3min；弃掉上清，加入1mL细胞培养基，悬浮细胞；将200μL细胞转移至含有5mL培养基的细胞培养皿中，在37℃的二氧化碳恒温培养箱中培养HEK293T细胞．
HEK293T细胞的转染：吸取125μL Opti培养基加入1.5 mL EP管中，然后加入3.75μL的Lipo3000，混合均匀；在另一个EP管中加入125μL Opti培养基，然后加入5μL的P3000和3μg质粒，混合均匀；将两个EP管中的溶液进行混合，室温静置5min，然后将混合液加入HEK293T细胞中．
1.4 电生理实验溶液成分
细胞贴附式记录模式研究TRAAK通道及其突变体半激活压力值（P50）的电极液和浴液成分．
浴液：150mmol/L KCl;5mmol/L EGTA和10mmol/L HEPES;pH 7.2（用KOH调节pH)
电极液：142.5mmol/L NaCl;7.5mmol/L KCl;5mmol/L EGTA和10mmol/L HEPES;pH 7.2（用NaOH调节pH)
全细胞的记录模式研究TRAAK通道及其突变体的全细胞电流的电极液和浴液成分．
浴液：142.5mmol/L NaCl;7.5mmol/L KCl;10mmol/L HEPES和5mmol/L EGTA;pH 7.2（用NaOH调节pH)
电极液：150mmol/L KCl;5mmol/L EGTA和10mmol/L HEPES;pH 7.2（用KOH调节pH)
1.5 细胞贴附式记录
用镊子夹取细胞爬片，置于35mm细胞培养皿中，将细胞培养皿放在载物台上，在显微镜下找到细胞，将生长状态良好并且带有绿色荧光的细胞移至视野中央；用内液冲灌器加电极液并赶走气泡，将电极小心地装在探头上；在显微镜下找到电极（电极电阻为5～7MΩ），移至视野中央，将电极入液，点击膜片钳放大器（Axopatch 700Bamplifier）软件上的第1个auto键，进行液接电位补偿；快速移动显微操作器，将电极靠近细胞，施加负压进行细胞封接，形成细胞贴附式记录模式，利用Clampex 10软件进行数据的采集和分析，用负压仪器Suction Control Pro unit施加压力，10mm汞柱为一个梯度，每次施加压力时间为500ms，直到电流达到最大状态后才停止施加压力．
1.6 全细胞记录
待细胞贴附式记录模式形成后，用注射器缓慢地将细胞吸破，此时仍然保持高阻封接，点击第2个auto键（膜片钳放大器软件第1个auto键的下方），进行快电容补偿，点击第3个auto键，进行细胞电容补偿，形成全细胞记录模式．
1.7 数据处理和分析
利用Clampex 10软件进行电生理数据的采集和分析，利用软件Clampfit 10.4进行电生理数据处理，包括基线的调平，假象信号的去除，数据的统计等；利用GraphPad Prism 6进行半激活压力值（P50值）的计算，电压-电流曲线和直方图的绘制以及曲线的拟合等；实验数据全部用平均值±标准误差（x±S.E.M）表示，实验至少重复4次，用非配对t检验（unpaired t test）的方法统计野生型和突变体之间的差异．
2 结果
2.1 TRAAK通道结构分析以及蛋白序列比对
尽管K2P通道家族具有结构和序列上的保守性，但是它们却表现出不同的功能特征
图1 TRAAK通道结构的8个部分和蛋白序列比对图 下载原图
Fig.1 Eight parts of the TRAAK channel structure and protein sequence alignment
(a)TRAAK通道8个部分结构图（PDB:3UM7[6]），分别是：N端-M1（红色）、Cap（深蓝色）、PH1（黄色）、M2（粉红色）、M3（浅蓝色）、PH2（棕黄色）、M4（绿色）和C端（银白色）；（b）人的TRAAK和TWIK-1蛋白序列比对图，每个部分之间用箭头隔开．
2.2 TRAAK通道及嵌合突变体M4-chimera的全细胞电流和机械敏感性电流记录
在全细胞记录模式下，我们分别记录了野生型TRAAK、嵌合突变体M4-chimera和未转染的HEK293T细胞的全细胞电流（图2(a）、（b）、（c），见第180页）．与野生型TRAAK通道相比，嵌合突变体M4-chimera的通道活性消失，不能记录到背景钾离子电流（图2(d）、（e），见第180页）．
在细胞贴附式记录模式下，通过负压装置施加压力，本实验分别记录野生型TRAAK和嵌合突变体M4-chimera的机械敏感性电流（图3，见第180页）．与野生型TRAAK通道相比，嵌合突变体M4-chimera不能记录到机械敏感性电流，暗示M4-chimera是一个没有活性的通道．
2.3 TRAAK通道嵌合突变体M4-upper-chimera和M4-lower-chimera的全细胞电流记录
为了进一步研究M4在TRAAK通道机械力门控中的作用，我们将M4分成上半部分（PDB:3UM7
2.4 M4的上半部分对于TRAAK通道的机械敏感性具有重要的调控作用
在细胞贴附式记录模式下，本实验分别记录嵌合突变体M4-upper-chimera和嵌合突变体M4-lowerchimera的机械敏感性电流（图5(a）、（b），见第181页）．嵌合突变体M4-upper-chimera和野生型TRAAK通道的最大机械敏感性电流是没有显著性差异的（图5(c），见第181页），但是嵌合突变体M4-upper-chimera的机械敏感性显著增强，通道半激活压力值（P50）从（102.1±5.6)mmHg下降到（54.04±5.7)mmHg（图5(d）、（e),P<0.001），而嵌合突变体M4-lower-chimera不能记录到机械敏感性电流，表明M4的上半部分能够调控TRAAK通道的机械敏感性．
图2 野生型TRAAK及其嵌合突变体M4-chimera的全细胞电流 下载原图
Fig.2 Whole-cell currents of wild-type TRAAK and M4-chimera
(a～b)TRAAK（蓝色，PDB:3UM7[6]）及其嵌合突变体M4-chimera的突变位点（TWIK-1粉红色PDB:3ukm[5]）示意图（上侧），膜电压从-100到+100mV梯度变化记录到的TRAAK(a），嵌合突变体M4-chimera(b）和未转染的HEK293T细胞（c）的全细胞电流（下侧）；（d）人的野生型TRAAK（黑色），M4-chimera（蓝色）和未转染的HEK293T细胞（红色）的全细胞电流与电压关系的统计分析；（e）膜电压为+100mV时，未转染的HEK293T细胞，人的野生型TRAAK和M4-chimera的全细胞电流的统计分析，用非配对t检验的方法比较未转染的HEK293T细胞和野生型TRAAK以及M4-chimera的全细胞电流的差异（*P<0.05,ns表示没有显著性差异，n≥5).
图3 野生型TRAAK及其嵌合突变体M4-chimera的机械敏感性电流 下载原图
Fig.3 Mechanosensitive currents of wild-type TRAAK and M4-chimera
(a～b）钳制电压为-60mV，负压力激活TRAAK和嵌合突变体M4-chimera产生的通道电流，从0mmHg开始施加负压，直到电流达到最大状态，10mmHg为一个梯度．
图4 TRAAK通道嵌合突变体M4-upper-chimera和M4-lower-chimera的全细胞电流 下载原图
Fig.4 Whole-cell currents of M4-upper-chimera and M4-lower-chimera
(a～b)TRAAK（蓝色，PDB:3UM7[6]）嵌合突变体M4-upper-chimera和M4-lower-chimera的突变位点（TWIK-1粉红色，PDB:3ukm[5]）示意图（上侧），膜电压从-100到+100mV梯度变化记录到的TRAAK嵌合突变体M4-upper-chimera(a),M4-lower-chimera(b）的全细胞电流（下侧）；（c）人的野生型TRAAK（黑色），M4-upper-chimera（黄色），M4-lower-chimera（紫色）和未转染的HEK293T细胞（蓝色）的全细胞电流与电压关系的统计分析，野生型和图2中的野生型为同一组数据，HEK293T和图2中的HEK293T为同一组数据．
图5 M4的上半部分对于TRAAK通道的机械敏感性具有重要的调控作用 下载原图
Fig.5 The upper part of M4can modulate the mechanosensitivity of TRAAK channel
(a～b）钳制电压为-60mV，负压力激活嵌合突变体M4-upper-chimera和M4-lower-chimera产生的通道电流，从0mmHg开始施加负压，直到电流达到最大状态，10mmHg为一个梯度；（c）野生型TRAAK和嵌合突变体M4-upper-chimera的最大机械敏感性电流的统计分析，用非配对t检验的方法比较野生型TRAAK和M4-upper-chimera的最大机械敏感性电流的差异（ns表示没有显著性差异，n≥5);(d）人的野生型TRAAK（右），嵌合突变体M4-upper-chimera（左）在钳制电压为-60mV时负压力激活的通道电流的拟合曲线；（e）钳制电压为-60mV时，野生型TRAAK及其突变体M4-upper-chimera的P50值的统计分析，用非配对t检验的方法比较野生型和突变体的差异（***P<0.001,n≥5).
3 讨论
机械敏感性离子通道广泛存在于真核生物和原核生物之间，能够将外部机械刺激转化成电信号，参与包括触觉、听觉、血压调节等多种生理过程
不同的机械敏感性离子通道可能具有特殊的结构区域调控其机械敏感性，例如OSCA通道的M0和M6跨膜螺旋对通道的机械敏感性具有重要的作用
TRAAK通道的M4通过构象改变，大约在氨基酸残基G268处发生旋转，封堵膜内开口，阻止脂酰链进入中心腔，从而使离子能够进入
本研究揭示了TRAAK通道M4的上半部分能够调控TRAAK通道的机械敏感性，但是TRAAK通道作为机械敏感性离子通道，它感受机械力的精准区域尚不清楚．接下来的研究需要找到TRAAK通道上感受机械力的结构区域，进一步阐明TRAAK通道感受机械力的分子机制，这对于研究TRAAK通道的机械力门控机制是至关重要的．本研究接下来的主要工作就是要通过一系列的嵌合突变，将TRAAK通道的其他7个部分（分别是N端-M1、Cap结构、PH1-filter、M2、M3、PH2-filter和C端），依次用非机械敏感性离子通道TWIK-1的同源区域进行替换，分别在全细胞和细胞贴附式两种记录模式下，记录这些嵌合突变体的全细胞电流和负压激活的电流，研究这些部分在通道机械敏感性中的作用．这种通过构建嵌合突变体研究TRAAK通道机械力门控机制的方法，也能够为其他机械敏感性离子通道的机制研究提供新的见解与基础．
